Western Blotting实验方法 2007-06-05 22:46
Western Blotting实验
一 仪器与试剂
1．仪器
高速组织捣碎机： SWISS KINEMATIC Ltd. Co（型号：PT1600E）
电泳仪：北京六一仪器厂（型号：DYY-8C）
电泳槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-24D）
转印槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-40D）
低温高速离心机：湖南湘仪公司（型号：H2050R）
超低温冰箱：美国FORMA公司（型号：702）
分光光度计：上海分析仪器总厂（型号：721）
脱色摇床：上海琪特分析仪器有限公司（型号：STS-2）
2．主要试剂：
Melanopsin一抗： ABCAM公司（货号:ab19383）
Sodium Channel一抗： Sigma公司（货号: S-6936）
AP标记山羊抗兔二抗：北京中山（货号：ZB-2308）
AP标记兔抗山羊二抗：北京中山（货号：ZB-2311）
蛋白质预染分子量marker(118,90,48,36,27,20kd)：Fermentas
NC膜：Millipore公司（型号：0.45um）
BCIP/NBT显色底物：amresco公司
电泳类生化试剂均为美国amresco公司产品
总蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所
3．主要试剂配制：
a. 储存液：
10% (w/v) SDS
10g SDS溶于90ml去离子水，轻轻搅拌溶解SDS，加水定容至100ml
1.5M Tris-HCl, pH8.8 (Resolving Gel Buffer) ，4℃保存
18.15g Tris base
80ml deionized water
18.15g Tris base溶于80ml去离子水，用6N HCl准确调节pH至8.8，加水定容至100ml
0.5M Tris-HCl, pH6.8 (Stacking Gel Buffer) ，4℃保存
6g Tris base
60ml deionized water
6g Tris base溶于80ml去离子水，用6N HCl准确调节pH至6.8，加水定容至100ml
10%(w/v) APS (fresh daily)
100mg ammonium persulfate溶于1ml去离子水
30％丙烯酰胺混合液（Acrylamide mix solution）
29%(w/v) Acrylamide
1%(w/v) bis-acrylamide
调PH<=7.0,棕色瓶暗处存放
10mg/ml苯甲基磺酰氟(PMSF)储存液： 用异丙醇溶解,-20度或4度保存
b. 工作液：
1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(4℃保存)
|
25mmol/L |
Tris |
|
250mmol/L |
Glycine(PH8.3)，对于<20kDa的小分子蛋白则用Tricine(N-三羟甲基甘氨酸) |
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0.1% |
SDS |
1×SDS凝胶电泳上样缓冲液
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50mmol/L |
Tris-HCl（PH 6.8） |
|
4%(W/V) |
SDS |
|
0.1%(W/V) |
Bromophenol blue (溴酚蓝) |
|
10%(V/V) |
Glycerol（丙三醇/甘油） |
|
5%(V/V) |
β-mercaptoethanol (巯基乙醇)(临用前加入) |
转移缓冲液(湿转)(4℃保存)
|
48 mmol/L |
Tris |
|
39mmol/L |
Glycine |
|
0.0375%(W/V) |
SDS |
|
20%(V/V) |
Methanol(甲醇) |
丽春红S(ponceau S)染液
2%丽春红S,30%三氯乙酸,30%磺基水杨酸,去离子水.
二 操作流程
1样品准备
1）分别取大约200mg组织加入液氮碾磨成粉末状，按每200mg组织加900μl上样Buffer(无溴酚蓝)和100ul 10mg/ml PMSF，混匀，玻璃匀浆器冰点匀浆
2）4℃，12000rpm离心10min
3）取上清夜-70℃冻存24hr
5）4℃ 12000rpm再次离心10min，取上清分装，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min，后于-20℃保存待用。
2定蛋白及计算电泳上样量
根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量，电泳上样量定为40ug
|
样品 |
OD |
总蛋白含量(mg/ml) |
|
标准管 |
0.144 |
0.615 |
|
1 |
0.367 |
1.567396 |
|
2 |
0.367 |
1.567396 |
|
3 |
0.279 |
1.191563 |
|
4 |
0.289 |
1.234271 |
|
5 |
0.227 |
0.969479 |
3电泳
1）安装好电泳装置
2）根据不同的指标配制相应浓度的分离胶，灌胶约3/5体积，液封(<10%用0.1%SDS,>10%用异丙醇)
3）30min后，待凝后倾去封液
4）配5%的浓缩胶，灌胶至距平板顶部2mm处，插入梳子, 30min后，待凝后拔出梳子，用去离子水清洗加样孔，用滤纸吸干
5）上样：各样品取50ug上样，marker取10μl上样(上样前需按说明书进行预处理)
6）缓慢加入内、外槽缓冲液，接通电源，90v电泳至指示剂进入分离胶后，调电压至150V继续电泳
7）当指示剂距平板底端1cm处时停止电泳
4 转膜及检测
1）准备2个Φ12cm的平面皿，一个装去离子水浸泡NC膜20min，另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min
2）取下胶，切除浓缩胶部分后，将分离胶浸入转移缓冲液中约5min
3）按顺序安装好转膜装置（黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板）
4）完全排除气泡， 4℃，100mA转膜2hr。
5）倾去转膜缓冲液，拆除转膜装置，将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min，用去离子水清洗至能看到条带，后用铅笔标出marker位置，再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右
6）将膜转移至另一容器中，用5%脱脂奶粉封闭, 4℃过夜
7）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗
8）37℃摇床孵育约2hr
9）PBST洗涤4次，每次5min
10）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗，37℃摇床孵育约30min
11）PBST洗涤4次，每次5min
12）将膜转移至尽可能小的容器中并加入BCIP/NBT底物，室温孵育30min
13）取出NC膜，用蒸馏水漂洗后晾干
14）扫描及分析
5 结果：
用Quantity One 4.3.1(Bio-rad)软件对照片进行分析(注意：Trace表示 Band光密度分布曲线下面积)
Melanopsin:
|
标本号 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
|
Trace |
9.85 |
14.2 |
19.7 |
21.6 |
22.9 |
Sodium Channel:
|
标本号 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
|
Trace |
19.9 |
20.8 |
24.8 |
27.3 |
26.8 |
实验记录：
|
一抗 |
Melanopsin |
Sodium Channel |
|
一抗CATALOG |
ab19383(ABCAM) |
S-6936 |
|
一抗稀释度 |
1:500-1000(600) |
1:200-600(400) |
|
二抗 |
山羊抗兔 |
山羊抗兔 |
|
二抗稀释度 |
1:600 |
1:600 |
|
目的蛋白条带位置 |
53/85kD |
200-250kD |
|
分离胶 |
8% |
6% |
|
积层胶 |
5% |
3.5% |
|
上样量 |
40ug |
40ug |
|
电泳电压 |
60V/80V |
70V/100V |
|
电转移电流 |
120mA(2h) |
120mA(4℃过夜) |
|
封闭(5％BSA或奶粉) |
37℃ 2h |
37℃ 2h |
重庆威斯腾生物工程 技术部